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免疫細胞轉(zhuǎn)染后細胞毒性較高是為何？
發(fā)布時間： 2023-01-05 點擊次數(shù)： 1455次免疫細胞轉(zhuǎn)染時先吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗?次。更換無血清培養(yǎng)基。準備轉(zhuǎn)染制備液，?滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液-200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液-200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。加?轉(zhuǎn)染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時。免疫細胞轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染24h后需要觀察轉(zhuǎn)染過程對細胞毒性情況，如果毒性較高，可能是以下原因造成的：1.初期細胞接種濃度太低。2.轉(zhuǎn)染復合物加入量過高，因為不同細胞對轉(zhuǎn)染的敏感度不同。3.轉(zhuǎn)染后6小時需更換培養(yǎng)基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培養(yǎng)基需要更換成有血清培養(yǎng)基。其次，轉(zhuǎn)染后需要對轉(zhuǎn)染效率進行檢測，比如觀察轉(zhuǎn)染后細胞熒光情況、qPCR驗證或WB檢測敲減或者過表達蛋白。4.對于β-gal表達載體：可用β-gal染色試劑盒進行細胞染色并觀察細胞。轉(zhuǎn)染效率高的細胞在染色孵育后3-4h即可觀察到，轉(zhuǎn)染效率低的細胞則需要更長的孵育時間。5.對于GFP表達載體：熒光顯微鏡下觀察細胞。如果細胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達，表達太弱的細胞無法鏡檢。GFP表達情況也能使用流式細胞儀進行檢測，同時可加入PI進行染色以監(jiān)測死細胞情況。若是轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率不高，可通過以下兩種方法增強轉(zhuǎn)染效率：1.復轉(zhuǎn)染，即轉(zhuǎn)染后12-24小時再次進行轉(zhuǎn)染，前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少；2.通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。
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