一.RAW264.7細胞背景介紹
細胞取材于Abelson小鼠白血病病毒誘發(fā)的腫瘤組織,是科研上尤為常用的炎癥細胞模型之一。該細胞易于增殖,有高效DNA轉(zhuǎn)染力,對RNA干擾敏感,常用作轉(zhuǎn)染宿主細胞和復(fù)制小鼠諾如病毒。細胞有sIg-、Ia-、Thy-1.2抗原陰性。據(jù)報道,該細胞建系后已不分泌且檢測不到病毒顆粒,XC斑點形成實驗陰性??梢钥贵w依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞,LPS或PPD處理2天后可誘導(dǎo)分解紅血球但對腫瘤靶細胞無作用。
二.RAW264.7細胞形態(tài)特征
1、RAW264.7細胞一般為圓形或橢圓形,細胞核為圓形或橢圓形,染色較深。貼壁特別牢固。若細胞呈多角形時,細胞為激活狀態(tài)。
2、RAW264.7具有吞噬能力,當細胞吞噬抗原后,細胞會釋放趨化因子,進一步促進細胞伸出偽足,增強粘附攀爬能力。若細胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣,細胞剛傳完代比較稀疏的時候,都會讓該細胞呈現(xiàn)梭形、長梭形,鏡下會看到具有細長偽足的小細胞被類似上皮的梭形細胞。
3、這個細胞屬于慢熱型的,很難消化,消化時間不夠則導(dǎo)致細胞無法消化下來,消化時間太長,傳代之后就會長個角給你看看,使勁吹打和細胞刀刮下來,則傳代之后不只是長個角給您看看了,還會飄起很多小黑點,而且這種細胞傳代時接種密度要大,否則也容易使巨噬細胞分化,細胞變形,并且不能恢復(fù),這是培養(yǎng)這種細胞時最需要注意的問題。
4、RAW264.7細胞生長時喜歡結(jié)伴。正常生長狀態(tài)應(yīng)該是一小片一小片的生長,片片之間不連接,等到長到更多更密的時候會連成大片,并疊加成層。疊加成層的細胞需要更多的營養(yǎng),一旦營養(yǎng)跟不上,細胞也會長個角給你瞅瞅,所以需要在細胞疊加的時候進行操作。
5、RAW264.7細胞傳代后貼壁迅速,半小時就能貼上一大片,剛貼壁是細胞呈圓形,折光度很好,鏡下觀察如小珍珠狀一個個地散落于瓶底面。若這個時候覺得活化的細胞較多,即長梭形的細胞較多時,可在細胞傳代消化重新貼壁半小時后進行換液,只保留生長狀況較好的細胞。
6、RAW264.7細胞的生長對血清要求比較高,血清不好會導(dǎo)致細胞生長情況變差。這是一個大胃王,所以在看到培養(yǎng)基變黃的時候不要遲疑,立馬換液處理。
1、培養(yǎng)之前,一切與細胞接觸的玻璃器皿和器具都要進行熱源處理。(200-250℃烘烤4-6h)
我們的消化及傳代方法:
方法一、消化液:0.5%胰酶、0.2EDTA,實驗前加溫到37℃以T25培養(yǎng)瓶為例:
1、細胞貼壁生長,長滿瓶底的95%時,棄去培養(yǎng)液,加D-HANKS漂洗兩次;
2、加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,消化37℃約2-5min,鏡下可看見細胞基本脫落即終止消化,收集消化后的細胞;(因為底層的細胞一般長有偽足,它緊緊的貼在瓶壁上,更難消化,消化時可先收集上層細胞,然后再消化底層細胞,每次消化下來的細胞不能放在同一瓶里)。
3、加入D-HANKS漂洗兩次,加入胰酶和EDTA的消化液1-2ml,37℃消化約2-5min,繼續(xù)消化底層的細胞,鏡下可看見細胞基本脫落即終止消化,單獨收集消化后的細胞;
4、加入新培養(yǎng)液10ML輕輕彈散混懸細胞,按需要分入新的培養(yǎng)瓶中,37℃CO2培養(yǎng)箱,幾小時后即可貼壁。
四、凍存的注意事項:
1、RAW264.7的凍存過程應(yīng)盡量減少熱源對細胞的影響,這樣對細胞種子的潔凈度有更好的保障。
2、這種細胞對空間狀態(tài)很敏感,所以復(fù)蘇的細胞密度或復(fù)蘇細胞數(shù)量控制在10^4-10^5為宜,這種接種密度接種在75cm2培養(yǎng)瓶中養(yǎng)2天后細胞密度即可到達70-80%,若細胞在復(fù)蘇的時候有偽足,先讓細胞生長到堆疊起來,然后再進行傳代,底部細胞棄掉,盡量選擇好的血清培養(yǎng),可讓新生細胞慢慢達到未激活狀態(tài)。
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