細胞轉染是細胞生物學和分子生物學的一種常用的技術手段。而轉染效率低卻是實驗童鞋們經常遇到的問題，尤其是原代細胞轉染，更是因為難度大，號稱誰碰誰死，而令人談虎色變。不，應該是談原代細胞色變。那么，當實驗進行到轉染這一步時有哪些坑要避免?需要注意的因素有哪些呢?

一、細胞系的選擇

細胞系選擇有時是實驗的需要，有時是實驗室條件的限制。如果有選擇的余地當然挑個容易做的。越是接近體內的真實情況的原代細胞，通常越是難于伺候。反之亦然。此外細胞本身的特性也是需要考慮的因素。有時需要根據(jù)細胞系來選擇合適的轉染方法;而有時一些啟動子在不同的細胞系中表現(xiàn)的功能也不同。這些都是設計實驗時需要考慮的因素，姑且不論。不過因為受限于特定的細胞，如何選擇合適的轉染方法就值得考究了。因為不同的細胞可能適用不同的轉染試劑和轉染條件。如果實驗室已經建立了全套方法，照做可也。如果是個新來的細胞株，最好查查資料看哪些成功轉染案例。

二、預實驗準備充足

我們做細胞轉染的時候，在開展正式實驗前要多做預試驗，優(yōu)化轉染條件。優(yōu)化轉染條件包括：轉染試劑的用量、DNA密度、細胞密度、轉染試劑和DNA混合孵育時間等等。

三、電轉染電壓控制

做電轉的時候，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況。不同的細胞，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗，多摸索條件。對于大多數(shù)細胞來說，其最佳電壓位于250-1250v/cm。另外，就是進行轉染的細胞應該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是很強的。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉染的質粒應該控制在4-6 μg，如果﹥10μg，轉染效率也大大降低。電擊后，應該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘，使細胞恢復損傷。

四、試劑品質的選擇

有時候轉染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況。根據(jù)經驗，盡量避免使用到過期的轉染試劑，因為過期后，就算沒有過失效期，但是細胞毒性大大增加，而轉染效率卻大大下降。千萬不要為了省錢，影響實驗進度哈。這轉染試劑這方面的選擇，目前已出到第三代多肽小分子材料的新型轉染試劑，推薦ZETA LIFE品牌的DNA、RNA高效轉染試劑（貨號：AD600150），轉染效率大大提高不少。

五、血清培養(yǎng)很重要

轉染后未及時加入血清，會導致細胞大量死亡。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)轉染實驗的經驗，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候，最好不要換液，不要打擾細胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清。過早的話，會引起未轉染的細胞不受控制生長。那么，什么是最佳時機呢?在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的最佳時機。不過要特別注意：對于RNA轉染，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關注的。所以血清的質量也是需要關注的。新加培養(yǎng)基的預熱對細胞轉染很有幫助。

六、防止細胞污染

細胞污染也是造成細胞死亡，轉染效率低下的一大原因。首先，轉染細胞用的質粒必須保證無菌。而現(xiàn)在市場上的一般的質粒提取試劑盒都做不到絕對無菌。業(yè)內有個一個獨門絕招：將提完質粒后或者提的最后一步，用75%乙醇沉淀，這樣就除菌了。

七、質粒數(shù)量保證

轉染用的質粒首先要保證數(shù)量，一般為2 μg以上。質粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質，也會影響轉染效率。這個時候，就應該對質粒進行純化和濃縮。

八、注意細節(jié)

在轉染之前更換一次37℃預溫的培養(yǎng)基，可提高轉染效率。轉染試劑和DNA/RNA混合物應當一滴一滴地滴下來，從培養(yǎng)皿一邊滴到另一邊，邊滴邊輕搖培養(yǎng)皿，以確保均勻分布和避免局部高濃度。這些都是一些細枝末節(jié)，但是如果不注意的話，也會造成轉染效率低下。

九、細胞狀態(tài)良好

十、注意鋪板的密度

十一、合適的培養(yǎng)基

健康的細胞培養(yǎng)是一切成功轉染的基礎。不同的細胞類型有不同的特性，需要特定的培養(yǎng)基、血清、補充添加劑等等。

十二、抗生素的控制

支原體、細菌、真菌污染，無論對于細胞培養(yǎng)或者轉染都是“不堪回首的痛”，可能會嚴重影響轉染結果，細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來防止污染。但是這些添加劑可能對轉染造成麻煩。比如青霉素和鏈霉素，就是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使抗生素可以進入細胞。這可能間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。所以整個過程都不要用抗生素。

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