材料與儀器

限制性內(nèi)切核酸酶 無(wú) DNase 的 RNase 細(xì)胞
細(xì)胞裂解緩沖液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸鹽緩沖液 蔗糖凝膠上樣緩沖液 TE
抽氣設(shè)備 多通道移液器 溫箱 振搖平臺(tái) Tupperware 容器

步驟

一、材料

1. 緩沖液和溶液

細(xì)胞裂解緩沖液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）

乙醇

NaCl/乙醇溶液

磷酸鹽緩沖液（PBS )

蔗糖凝膠上樣緩沖液

TE (pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

限制性內(nèi)切核酸酶

無(wú) DNase 的 RNase

3. 專用設(shè)備

與帶閥門的真空管相連的抽氣設(shè)備

多通道移液器，8 或 12 道

溫箱，預(yù)設(shè)至 60℃。

振搖平臺(tái)

Tupperware 容器

4. 細(xì)胞和組織

在 96 孔微培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的細(xì)胞

二、方法

1. 用藍(lán)色尖頭或者巴斯德移液管吸去 96 孔培養(yǎng)板每個(gè)培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液。

只要小心不接觸細(xì)胞層，通常不用毎個(gè)培養(yǎng)孔換新的尖頭。

2. 每個(gè)培養(yǎng)孔中的細(xì)胞用 100 μl 磷酸鹽緩沖液沖洗 2 次。

3. 用多通道移液器在微培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入 50 μl 細(xì)胞裂解液。將數(shù)張濕的吸水紙置入一個(gè)聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再將盛有細(xì)胞裂解液和細(xì)胞的微培養(yǎng)板放在吸水紙上，用蓋封嚴(yán)盒子。

4. 將封好的盒子在 60℃ 溫箱中溫育 12~16 h。

5. 將盒子移出溫箱，取出培養(yǎng)板平放在工作臺(tái)上，冷卻數(shù)分鐘，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混勻，直接將培養(yǎng)板于室溫溫育 30 min。溫育末期應(yīng)見(jiàn)到纖維狀的核酸沉淀。

6. 緩慢地倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)板，將乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀應(yīng)黏附在培養(yǎng)孔的底部。將每個(gè)培養(yǎng)板倒置于干燥的吸水紙上，使殘余乙醇從培養(yǎng)板流出。

7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移動(dòng)核酸沉淀。按步驟 6 倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)板以去除 70% 乙醇。在吸水紙吸去多余的液體。用 70% 乙醇再?zèng)_洗沉淀 2 次。

8. 使培養(yǎng)板在室溫干燥直至最后的乙醇揮發(fā)。如果基因組 DNA 將用于 PCR 分析，進(jìn)行步驟 9。如果 DNA 將用于 Southern 雜交，進(jìn)行步驟 10、11 和 12。

9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室溫緩和地震搖 12~16 h 使 DNA 溶解。

10. 如果 DNA 將用于 Southern 雜交，制備下列限制性內(nèi)切核酸酶混合物；每孔需 40 μl。

H2O                                      0.8倍體積

10X限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液   0.1倍體積

無(wú) DNase 的 RNase               10 μg/ml

使用前每 40 μl 混合物加入 10 個(gè)單位限制性內(nèi)切核酸酶。

11. 用多通道移液器在每個(gè)孔中加入 40 μl 限制性內(nèi)切核酸酶反應(yīng)混合物。反復(fù)抽吸數(shù)次使孔中內(nèi)容物混合，小心避免產(chǎn)生氣泡。按步驟 3 用 Tupperware 容器制作濕盒, 將培養(yǎng)板放入，使反應(yīng)在適宜的消化溫度溫育 12~16 h。

12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝膠上樣緩沖液終止反應(yīng)，進(jìn)行 Southern 印跡和雜交以分析消化的 DNA。

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