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從大規(guī)模裂解物中制備λ噬菌體顆粒實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間: 2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù): 1153次原理
從大規(guī)模培養(yǎng)物中制備的 λ 噬菌體,可在高鹽存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的辦法從裂解物中回收得到。殘余的細(xì)胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在進(jìn)一步純化之前,建議測(cè)定噬菌體制備物的得率。
材料與儀器
大腸桿菌培養(yǎng)物
氯仿 NaCl 聚乙二醇 SM 胰 DNaseⅠ
Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào) 量筒步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
氯仿,NaCl ( 固體),聚乙二醇(PEG 8000)(每 500 ml 培養(yǎng)物大約用 50 g),SM。
2. 酶和緩沖液
胰 DNase Ⅰ ( 1 mg/ml),胰 RNase ( 1 mg/ml ) 于 TE 中(pH 7.6 )。
3. 離心機(jī)和轉(zhuǎn)子
Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)型號(hào)。
4. 專(zhuān)用設(shè)備
量筒(2 L)。
5. 載體和菌株
大腸桿菌培養(yǎng)物,經(jīng) λ 噬菌體感染和裂解。
二、方法
用 PEG 沉淀噬菌體顆粒
1. 將含有 λ 噬菌體的裂解培養(yǎng)物冷卻至室溫,加胰 DNase Ⅰ 和 RNase 至終濃度均為 1 μg/ml,室溫溫育 30 min。
2. 每 500 ml 培養(yǎng)物加入 29.2 g 固體 NaCl(終濃度為 1 mol/L),攪拌使其溶解。將培養(yǎng)物冰浴 1 h。
再用 PEG 沉淀噬菌體顆粒中,NaCl 的加入促進(jìn)了噬菌體顆粒與細(xì)胞碎片之間的分離,因此是有效沉淀所需的。一些研究人員喜歡在加入 PEG 的同時(shí)加入 NaCl,那樣的話(huà)步驟 3 的離心過(guò)程可被省略。但需要告知的是,只有當(dāng)噬菌體生長(zhǎng)良好且其在最初裂解培養(yǎng)物中的滴度大于 2X1010 pfu/mI 時(shí),PEG 和 NaCl 的同時(shí)加入才能有效地沉淀噬菌體顆粒。
3. 4℃,11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中)離心 10 min 以去除細(xì)胞碎片,將四份培養(yǎng)物的上清混合置于 2 L 的干凈量筒中。
4. 測(cè)定所收集上清的總體積,然后轉(zhuǎn)移至 2 L 的燒瓶中,加固體 PEG 至終濃度為 10% (m/V,如 500 ml 上清加 50 g PEG),于室溫用磁力攪拌器慢慢攪拌溶解 PEG。
5. 將噬菌體/PEG 溶液轉(zhuǎn)移至聚丙烯離心管中,于冰水浴冷卻,至少放置 1 h 以便使噬菌體顆粒發(fā)生沉淀。
6. 4℃,11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中)離心 10 min 以回收沉淀的噬菌體,去上清,將離心管倒過(guò)來(lái)傾斜放置 5 min,以便使剩余液體充分流干。用移液器吸去殘余的液體。
用氯仿抽提細(xì)菌碎片
7. 用一帶橡皮球的寬口吸管將噬菌體沉淀輕輕地重懸于 SM 中(針對(duì)步驟 3 每 500 ml 上清加 8 ml SM),將離心管傾斜放置,使 SM *覆蓋并浸泡噬菌體沉淀,室溫放置 1 h。
*但溫和地沖洗整個(gè)離心管壁,因?yàn)槭删w沉淀會(huì)黏附在管壁上,尤其當(dāng)離心管比較陳舊有凹痕時(shí)。而如果劇烈地吸取噬菌體,容易造成其尾部的斷裂。
8. 通過(guò)加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸浮液中的 PEG 和細(xì)胞碎片,溫和振蕩 30 s。4℃,3000 g(4300 r/min 于 Sorvall GSA 轉(zhuǎn)子中)離心 15 min 以分離有機(jī)相和親水相,回收含噬菌體顆粒的親水相。
為了測(cè)定得率,用凝膠電泳分析噬菌體懸浮液。以上就是本期的內(nèi)容,更多資訊,歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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