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如何做好細胞的培養(yǎng)、傳代、凍存和復蘇?
發(fā)布時間: 2021-12-07 點擊次數(shù): 1844次1.準備工作:
根據(jù)培養(yǎng)細胞的特性,提前準備好適合的培養(yǎng)基和血清等。最好沿用細胞原來的培養(yǎng)條件,以免細胞在新環(huán)境下還需要過渡適應。同時,充分了解到細胞的生長特性和形態(tài)特征,便于后續(xù)的培養(yǎng)觀察。
2.貼壁細胞傳代:
1)移棄使用過的細胞培養(yǎng)液。(不要直接倒掉,避免瓶口殘留導致易污染)
2)使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液(PBS)沖洗細胞。從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液,以避免攪動細胞層,前后搖晃容器數(shù)次,最后移棄沖洗液。(洗去殘留的血清,避免影響胰酶的活性。)
3)以 25 cm2的培養(yǎng)瓶為例,向瓶內(nèi)加入1ml胰蛋白酶-EDTA(請根據(jù)各細胞的指引使用合適的濃度)消化液,輕輕搖動培養(yǎng)瓶,使消化液流遍所有細胞表面,放到37 ℃ 孵育。通常,幾分鐘內(nèi),會發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大,傾斜培養(yǎng)瓶時細胞層能自然流下,此時應加入2-3ml含血清的*培養(yǎng)液終止消化(細胞解離所需時間請參考各細胞的指引,并建議每隔30秒在顯微鏡下觀察細胞的解離情況)。另外,并不是所有貼壁細胞都適用采用胰蛋白酶進行解離,請根據(jù)各細胞的指引選擇合適的解離方法。
4)使培養(yǎng)瓶傾斜,吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)液體輕輕沖向原細胞生長表面,重復該動作2-3次,使所有細胞沿瓶底流下,再輕柔地把細胞吹打成單個懸液(吹打過程中應避免氣泡的產(chǎn)生)。
PS:對于難消化的細胞,盡量不要通過用力吹打的方式來處理,以免對細胞產(chǎn)生物理損傷??梢韵葘⒁呀?jīng)消化的細胞分出來,及時終止消化。然后再對仍然貼壁的細胞進行再次消化。做到分層消化,避免易消化細胞長時間在胰酶消化下受損。
5)把所有的細胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘后移棄上清。
6)加入新的含血清*培養(yǎng)液重懸成單細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補足新的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。
7)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的貼壁情況。
3.懸浮細胞傳代:
因懸浮生長細胞不貼壁,故傳代時不必采用酶消化方法,而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。
1)直接傳代時,靜置5-10分鐘,待懸浮細胞慢慢沉淀到器皿底部后,吸掉1/2-2/3原培養(yǎng)液,補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,混勻成細胞懸液。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,輕輕搖晃混勻。
2)離心傳代時,將細胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清后,加入新鮮的含血清*培養(yǎng)液重懸。按各細胞指引推薦的傳代比例,把細胞懸液均勻分到各培養(yǎng)器皿中,補足新鮮的含血清*培養(yǎng)液,輕輕搖晃混勻。
3)放到37 ℃ 孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
4.貼壁懸浮混合型細胞傳代:
先將懸浮的細胞收集,再參考“貼壁細胞傳代"方法進行消化收集,一起接種到培養(yǎng)器皿中。
PS: 懸浮細胞生長中一般對細胞密度要求比較高,培養(yǎng)中最好參考指南控制好細胞密度,不能過密也不能過稀。
5.細胞凍存:
1)按照“細胞傳代步驟"中的方法收集細胞。
2)加入細胞凍存液(一般10%DMSO+對應細胞的*培養(yǎng)液),使細胞的終密度為(5~10)×105個/ml,移入細胞凍存管中。
3)程序降溫(以使用需異丙醇的Nalgene程序降溫盒為例):4℃ 30min→-80℃過夜→液氮。(一定不能省略4℃的30min,否則凍存液無法滲透到細胞,易產(chǎn)生冰晶導致細胞受損。)
6.細胞復蘇:
1)取出貯存的細胞,待液氮揮發(fā)后,馬上37℃水浴中輕輕搖動使快速融化(通常2min內(nèi),時間長了細胞狀態(tài)會受影響)。為避免劇烈的溫差變化導致凍存管炸裂,操作該步時請配戴防護面罩或防護目鏡。
PS:干冰運輸?shù)膬龃婕毎盏胶笮枰⒖谭湃肷畹蜏乇浠蛞旱?,至?d后再進行復蘇操作。
2)轉(zhuǎn)移到無菌操作臺,75%酒精擦拭凍存管外部。
3)將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10-20ml經(jīng)預熱的含血清*培養(yǎng)液離心管中,800-1000rpm離心3-5分鐘,移棄上清。
4)重新加入經(jīng)預熱的含血清*培養(yǎng)液重懸細胞,以約(3~5)×105個/ml密度接種到培養(yǎng)器皿中。
5)放到37℃孵育,第二天顯微鏡下觀察細胞的情況。
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