一、材料

無菌

實(shí)驗(yàn)前 3 天制備飼養(yǎng)層（見方案 23.4)。照射 3T3 細(xì)胞（30 Gy) 和人成纖維細(xì)胞（70 Gy)，最好用含較多細(xì)胞的懸液
FAD:Wu 等 [1982] 研制的一種用于飼養(yǎng)層培養(yǎng)的高鈣培養(yǎng)液，含有 Ham's F12、DMEM 和添加物。Ham F12 和 DMEM 混合培養(yǎng)液（1:3) 添加 1.8Xl0-4mol/L 腺嘌呤、10-10mol/L 霍亂毒素、1～10ng/L EGF、0.4ug/ml 氫化可的（木公）、5%～10% FCS、100U/ml 青霉素和 50ug/ml 鏈霉素

角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（keratinocytegrowth medium，KGM ): 基于 Boyce 和 Ham [1983] 研制的 MCDB153 培養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液（見表 10.1 和附錄Ⅱ)，添加低鈣（0.03～0.5 mmol/L ) 牛垂體提取物?？杉尤?CaCl2，以升高鈣離子濃度
角 質(zhì)形成細(xì)胞限定培養(yǎng)液（keratinocyte-definedmedium，KDM ) : 基于 Boyce 和 Ham 于 1983 年研制的 MCDB153 培養(yǎng)液的無血清培養(yǎng)液（見附錄 1)，是化學(xué)成分限定性培養(yǎng)液，Stark 等 [1999] 曾在器官型培養(yǎng)試用過

SKDM(supplemented KDM )：
(a) 不含垂體提取物的 KDM (Promocell、Clonetics)；
(b) 添加 5ug /ml 胰島素、0.5ug/ml 氫化可的（木公）、0.1ng /ml rhEGF 、20ug/ml
轉(zhuǎn)鐵蛋白、0.1% 髙純度血清白蛋白（無內(nèi)毒素和脂肪酸，如 A-8806,Sigma) 和 50ug/ml 抗壞血酸；
(c) 調(diào)整鈣離子濃度至 1.3 mmol/L ;
(d ) 原代角質(zhì)形成細(xì)胞可用未包被的塑料培養(yǎng)皿在 SKDM 中培養(yǎng)，然而細(xì)胞增殖活性較低。將角質(zhì)形成細(xì)胞接種在涂有 I 型膠原蛋白的培養(yǎng)皿上時(shí)，生長(zhǎng)情況可得到改善。

在含有成纖維細(xì)胞的膠原凝膠上作器官培養(yǎng)時(shí)，SKDM 對(duì)表皮生長(zhǎng)和分化的作用與 FAD 的作用無區(qū)別

D-PBSA

0.5% EDTA(約 15 mmol/L )

分析級(jí)甘油
添加 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 培養(yǎng)液

酶：
(a) 熱解素（T -7902,Sigma)；
(b)0.2% 和 0.6% 胰蛋白酶（1:250)；
(c)2.4U/mlⅡ型 dispase (Boehringer Mannheim)。

聚維酮碘溶液（10% 碘）

低溫保存管

50 ml 離心管

尼龍網(wǎng)

細(xì)胞濾器（BectonDickinson)

100 mm 細(xì)菌培養(yǎng)級(jí) Petri 培養(yǎng)皿

手術(shù)刀和彎鑷



二、操作步驟

取材

1. 人皮膚常取自新生兒和幼兒的包皮，也可在手術(shù)時(shí)或尸檢后（死后 48 h 之內(nèi)）取自軀干皮膚。在貼壁和增殖方面，自新生兒和幼兒的包皮分離的角質(zhì)形成細(xì)胞優(yōu)于自成人軀干皮膚分離的細(xì)胞。

2．將皮膚組織塊在聚維酮碘溶液（10% 碘）中孵育 30 min ，以預(yù)防感染。聚維酮碘溶液降低角質(zhì)形成細(xì)胞的活力不明顯。

3．用 D-PBSA 浸洗 10 min,2 次。

分離表皮最好分離全厚皮膚

4．用 Castroviejo 取皮刀（Storz Instrument) 切取全厚皮膚，厚度為 0.1～0.2 mm 。可用彎剪除去皮下組織和部分真皮。

5. 用手術(shù)刀將皮膚切成 1 cmX2 cm 小塊。

6. 用 D-PBSA 浸洗組織塊 2～5 次。

7. 通過下列其中之一步驟用蛋白酶孵育組織塊。
(a) 胰蛋白酶：在 37℃ 條件下，將皮膚組織塊放入含有 0.6% 胰蛋白酶的 D-PBSA (pH 7.4) 中，漂浮 20～30 min。此步驟也對(duì)全厚皮膚消化很有效。
(b) 冷胰蛋白酶在 4℃ 條件下，將組織塊放人預(yù)冷的 0.2 % 胰蛋白酶中，漂浮 15～24 h 。需用酚紅顯示胰蛋白酶液的 pH, 以免 pH 變化引起酶活性和細(xì)胞活力的改變。
(c) II 型 dispase: 在 37℃ 條件下，用 2.4U/ml dispase 畔育 30 min 。
(d ) 熱解素：在 4℃ 條件下，用 0.5 mg/ml 熱解素孵育 12～16 h 。

8. 仔細(xì)觀察表皮的分離情況。當(dāng)在皮膚組織塊邊緣見到表皮開始分離時(shí)，將組 織塊放人 100 mm 塑料 Petri 培養(yǎng)皿內(nèi)，真皮側(cè)朝下。然后，加入 5 ml 含有血清的*培養(yǎng)液。

9. 用兩把細(xì)彎鑷剝下表皮，然后將表皮收集入含有 20 ml *培養(yǎng)液的 50 ml 離心管。
(a) 用胰蛋白酶分離時(shí)，通過用吸管輕輕吹打和用孔徑為 100um 的尼龍網(wǎng) (細(xì)胞濾器，B-DBiosciences) 過濾即可從表皮分離出有活力的角質(zhì)形成細(xì)胞。 .
(b) 從經(jīng) dispase 或熱解素消化分離的表皮獲取細(xì)胞時(shí)，需在 37℃ 條件下將表皮用胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液（濃度分別為 0.2% 和 0.05%) 孵育消化 10 min。

10. 用胰蛋白酶分離皮膚后，從真皮輕輕刮取附著不牢固的表皮細(xì)胞，然后將刮取的細(xì)胞加入表皮細(xì)胞懸液。如果角質(zhì)形成細(xì)胞的純度不太重要，這一方法能夠獲得較多的表皮細(xì)胞。但是，角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)中有很多間質(zhì)細(xì)胞污染。

11．通過離心（100 g，10 min) 將分離的表皮細(xì)胞用培養(yǎng)液洗 2 次。計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和不吸收臺(tái)盼藍(lán)的活細(xì)胞數(shù)（見方案 21.1)。

原代培養(yǎng)

12. 調(diào)整細(xì)胞密度。在 37℃ 條件下，用 FAD 或 KGM 接種細(xì)胞。
(a) 3 天前將有絲分裂后的 3T3 細(xì)胞 [Rheinwald and Green，1975](見方案 14.3) 或皮膚成纖維細(xì)胞 [Limat et al，1989] 接種于培養(yǎng)皿。以 2X104～5X104 個(gè)/cm2 密度將角質(zhì)形成細(xì)胞接種在飼養(yǎng)細(xì)胞上，用 FAD 培養(yǎng)。
(b) 如不用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在 FAD 以高密度（1X105 ～5X105 個(gè)/cm2) 接種原代角質(zhì)形成細(xì)胞，并在傳代培養(yǎng)時(shí)保持高細(xì)胞密度。
(c) 在含有低濃度鈣離子（0.03～0.1 mmol/L 的 KGM 中，以低密度 (1X103 個(gè)/cm2) 或高密度（5X104 個(gè)/cm2) 接種細(xì)胞。用同樣的培養(yǎng)液作傳代培養(yǎng)。
(d) 在 SKDM 中，細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)較慢，故最好將 SKDM 用于需要增殖活性低的實(shí)驗(yàn)。

13. 1～3d 后，細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后，用培養(yǎng)液充分浸洗細(xì)胞，除去未貼壁的死細(xì)胞和已分化的細(xì)胞。然后/加人 FAD 或 KGM ，繼續(xù)培養(yǎng)：可通過調(diào)整 KGM 的鈣離子濃度促進(jìn)角化和減慢生長(zhǎng)。

傳代培養(yǎng)

14. 傳代培養(yǎng)方法如下。
(a) 用 FAD 培養(yǎng)
    (i) 用 1.3～2.7 mmol/L (0.05% 0.1%) EDTA 液孵育細(xì)胞 5～15 min ，使細(xì)胞去附著。此時(shí)，可見細(xì)胞間隙變大。
   (ii) 在 37℃ 條件下用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L(0.05%) EDTA 液孵育細(xì)胞 5～10 min，然后用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞充分去附著。
(b) 用 KGM 培養(yǎng)
   (i) 由于 KGM 的鈣離子濃度較低，不需要用 EDTA 預(yù)處理。
  (ii) 如用 FAD 培養(yǎng)方法，用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液孵育細(xì)胞。

低溫保存

15. 為了保存大量自同種組織分離得到的細(xì)胞，常需進(jìn)行低溫保存。取匯合前的原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，低溫保存效果好。
(a) 按前述的方法用胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心（100 g，10 min)。
(b) 用含有血清的*培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。
(c) 用含有 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 將細(xì)胞密度調(diào)整至 2X106 個(gè)/ml，
然后將細(xì)胞分裝人凍存管。
(d) 在 4℃ 條件下將凍存管放置 1～2 h。
(e) 用程控冷凍儀（Planer) 按 1℃/ min 的冷卻速度冷凍細(xì)胞。也可將凍存
管插人充滿異丙醇的細(xì)胞冷凍盒（如 1℃ 冷凍容器，商品號(hào) 5100-0001，NalgeNunc) 中。這樣，將細(xì)胞冷凍盒放入-80℃ 冷凍箱時(shí)，使冷卻速度適當(dāng)。
(d) 細(xì)胞復(fù)蘇：
   (i) 將凍存管在 37℃ 水浴中快速融化。
   (ii) 用培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋 10 倍。
   (iii) 將細(xì)胞離心后，用所需培養(yǎng)液將細(xì)胞混懸至合適密度。然后，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿。